دانشمندان جداسازی sarbecovirus خفاش را در ژاپن کشف کردند

در مطالعه اخیر منتشر شده در بیماری های عفونی در حال ظهورمحققان آزمایش های جداسازی sarbecovirus خفاش را با استفاده از Rhinolophus cornutus خفاش‌هایی از چندین منطقه در ژاپن که از نظر فیلوژنتیکی در یک دسته از ویروس‌های مرتبط با سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) قرار داشتند.

بتا-کرونا ویروس های انسانی (β-CoVs) بسیار بیماری زا مانند کروناویروس سندرم حاد تنفسی (SARS-CoV)، SARS-CoV-2، و سندرم تنفسی خاورمیانه (MERS-CoV) از خفاش ها منشأ گرفته اند. بنابراین، نظارت β-CoV خفاش برای بهبود درک و ارزیابی پتانسیل سرریزهای β-CoV در انسان ضروری است. ساربکویروس های شناسایی شده در کشورهای آسیایی مانند چین از نظر ژنتیکی متنوع گزارش شده است. با این حال، تنوع ژنتیکی و توزیع sarbecoviruses خفاش در ژاپن به خوبی مشخص نشده است و نیاز به بررسی بیشتر دارد.

نویسندگان مطالعه حاضر قبلاً نشان دادند که یک شبه ویروسی مبتنی بر VSV (ویروس استوماتیت تاولی) که شامل پروتئین S (اسپیک) ساربکویروس Rc-o319 از R. cornutus تنها سلول‌های بیان‌کننده Rc-ACE2 (آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2) را آلوده کرده‌اند، اما نه سلول‌های بیان‌کننده ACE2 (hACE2) انسانی یا سایر موارد راینولوفوس سلول های بیان کننده ACE2

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان در مورد شناسایی، جداسازی، و خصوصیات بیولوژیکی و ژنتیکی sarbecoviruses منشا گرفته از خفاش ها در مکان های مختلف ژاپن گزارش دادند.

نمونه مدفوع از R. ferrumequinum و R. cornutus خفاش گونه های موجود در استان های چیبا، شیزوئوکا و نیگاتا. RT-PCR بلادرنگ (واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس) انجام شد و تیم سلول های Vero بیانگر RcACE2 (Vero-RcACE2) را بر اساس پروتئاز Vero/transmembrane ایجاد کرد. سسلول های ارین 2 (TMPRSS2).

آنالیز توالی یابی نسل بعدی (NGS) برای تعیین توالی کل ژنوم تمام ایزوله های ویروسی انجام شد و توالی ها در GenBank سپرده شدند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل نمودار شباهت برای توالی ژنوم کامل با استفاده از هر ایزوله به عنوان یک پرس و جو انجام شد. یک درخت فیلوژنتیک از ساربکوویروس های خفاش در ژاپن بر اساس توالی های کل ژنوم با تجزیه و تحلیل حداکثر احتمال و تکرارهای بوت استرپ ساخته شد.

S RBM (موتیف اتصال گیرنده) جدایه‌های خفاش از ژاپن با سایر ساربکوویروس‌ها همسو شدند. برای ارزیابی سینتیک رشد جدایه‌های ساربکویروس از خفاش‌ها در ژاپن، R. cornutus جدایه های خفاش Rc-os20، Rc-o319، Rc-mk2، و Rc-kw8 یا SARS-CoV-2 (سویه B.1.1.7) به Vero-RcACE2 تلقیح شدند. [RcACE2, Vero/TMPRSS2 (WT)]سلول های Vero-hACE2 (hACE2) یا Vero-ACE2KO (ACE2KO) و تیترهای ویروسی با استفاده از سنجش پلاک تعیین شد.

نتایج

جدایه ها رشد موثری را در سلول هایی که بیان کردند نشان دادند راینولوفوس کورنتوس ACE2 اما در سلول‌های بیان‌کننده hACE2 به خوبی رشد نکرد، که نشان می‌دهد جدایه‌های خفاش دارای محدوده باریکی از میزبان بودند. تجزیه و تحلیل RT-PCR تشخیص موفقیت آمیز توالی ژن پوششی (E) sarbecoviruses را در یک یا دو امکان پذیر کرد. Rhinolophus cornutus نمونه در هر استان ساربکویروس‌های خفاش با استفاده از کشت‌های سلولی Vero-RcACE2، با اثرات سیتوپاتیک بسیار زیاد و تشکیل سینسیتیوم از نمونه‌های مثبت RT-PCR از مدفوع خفاش از هر استان، با موفقیت جدا شدند.

جدایه های خفاش از استان های Shizuoka، Niigata و Chiba به ترتیب به عنوان Rc-kw8، Rc-os20 و Rc-mk2 طراحی شدند. علاوه بر این، Rc-o319 با استفاده از کشت سلولی Vero-RcACE2 جدا شد. برعکس، همه نمونه هایی از Rhinolophus ferremuquinum گونه‌ها منفی بودند، که نشان می‌دهد ساربکوویروس‌های خفاش بین آنها توزیع شده است Rhinolophus cornutus خفاش ها در ژاپن توالی ها از همه سویه های خفاش جدا شده از ژاپن بسیار همولوگ بودند (بین 95٪ و 97٪). با این حال، Rc-os20 و Rc-mk2 فاقد کدگذاری منطقه برای ORF8 (قاب خواندن باز 8) بودند.

این تیم شباهت‌های زیادی را بین جدایه‌های خفاش‌ها در سراسر توالی ژنوم مشاهده کردند، به استثنای مکان‌هایی که برای دامنه اتصال گیرنده ژن S (RBD) و دامنه N ترمینال (NTD) کدگذاری می‌کنند. با این حال، Rc-kw8 و Rc-o319 NTDs حفظ شدند. هیچ نوترکیبی قابل توجهی در بین جدایه های خفاش مشاهده نشد. در تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک، جدایه ها در یک خوشه ژنتیکی واقع در یک کلاد ژنتیکی شامل ساربکویروس های مربوط به SARS-CoV-2 مشاهده شدند.

یافته‌های آنالیز فیلوژنتیک S RBD نشان داد که جدایه‌های ژاپنی با استفاده از مولکول‌های ارتولوگ ACE2 به عنوان گیرنده در کلاد ژنتیکی ارگانیسم‌های ویروسی قرار گرفته‌اند. بنابراین، تیم فرض کرد که سویه های جدید جدا شده از ژاپن از RcACE2 به عنوان گیرنده استفاده می کنند. جدایه های خفاش به طور موثر فقط در Vero-RcACE2 تکثیر می شوند اما در سلول های Vero-ACE2KO، Vero/TMPRSS2 یا Vero-hACE2 تکثیر نمی شوند. یافته‌ها نشان داد که جدایه‌های خفاش برای عفونت‌زایی به RcACE2 وابسته هستند.

در مقابل، SARS-CoV-2 همانندسازی کارآمدی را در سلول‌های Vero-RcACE2، Vero-hACE2 و Vero/TMPRSS2 نشان داد، اما در کشت‌های سلولی Vero-ACE2KO به خوبی تکثیر نشد، که نشان می‌دهد عفونت‌پذیری آن‌ها به حضور گیرنده‌های متعدد ACE2 بستگی دارد. از جمله کسانی که از Rhinolophus cornutus خفاش ها یافته ها نشان داد که جدایه های خفاش ژاپن تنها از bRcACE2 به عنوان گیرنده استفاده می کنند.

اکثر توالی‌های ژنومی در میان سویه‌های ژاپنی بسیار حفاظت شده بودند، که ممکن است از آن زمان باشد راینولوفوس spp گونه های خفاش به فواصل نسبتاً کوتاه مهاجرت می کنند و اغلب با گروه های دیگر خفاش ها تماس متقابل ندارند. استثناها مناطق S کد کننده برای RBD و NTD بودند که تنوع ژنتیکی گسترده ای را به دلیل فشارهای ایمونولوژیک نشان دادند، که نشان می دهد خفاش ها در زمان های اخیر از سویه اجدادی جدا شده اند.

به طور کلی، یافته‌های مطالعه نشان داد که جدایه‌های خفاش از batACE2 به شکل گیرنده‌هایی بدون تکثیر در سلول‌هایی که hACE2 را بیان می‌کنند، استفاده می‌کنند، بنابراین، یک نوع مشخصه است و نشان‌دهنده پتانسیل آلودگی کمیاب در انسان است. ساربکوویروس ها ممکن است جهش یافته و منجر به عفونت های انسانی از طریق گونه های میزبان واسط در دام یا حیات وحش شوند. بنابراین، مطالعات اپیدمیولوژی sarbecovirus در حیوانات وحشی، از جمله خفاش، باید با ارزیابی خطر طولانی مدت از پتانسیل آنها برای انتقال مشترک بین انسان و دام انجام شود.